感染組織的宏基因組測(cè)序，您選對(duì)DNA抽提方法了嗎？

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前言

16S核糖體RNA基因（rRNA）的擴(kuò)增測(cè)序及分析是評(píng)價(jià)臨床標(biāo)本細(xì)菌群落多樣性常用的方法。該方法利用與16S rDNA高度保守區(qū)域結(jié)合的引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增16S rRNA基因，對(duì)擴(kuò)增得到的產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序及數(shù)據(jù)分析獲得樣本中細(xì)菌群落的OTU，從而判斷樣本中的微生物種類。該方法優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便快速，缺點(diǎn)是大部分微生物無(wú)法鑒定到種的水平。

隨著測(cè)序平臺(tái)發(fā)展和測(cè)序成本的降低，人們對(duì)微生物組成的研究從系統(tǒng)發(fā)育研究（16S rRNA）轉(zhuǎn)向了宏基因組測(cè)序。通過(guò)覆蓋微生物群落的所有物種的基因組信息，使物種鑒定結(jié)果具有更高的特異性和敏感性。宏基因組測(cè)序還可以提供酶組成或代謝途徑、細(xì)菌功能基因組成以及功能與系統(tǒng)發(fā)育之間的基因組聯(lián)系的遺傳證據(jù)。另外，宏基因組學(xué)不僅可以分析來(lái)自細(xì)菌源的序列，還可以分析來(lái)自真菌、病毒和寄生蟲的序列。基于上述優(yōu)勢(shì)，使得直接分析單個(gè)樣本中的微生物組數(shù)據(jù)成為研究臨床樣本微生物多樣性的常用方法。

然而，在研究人類疾病與微生物之間的關(guān)系時(shí)，由于宿主DNA的污染，宏基因組測(cè)序在實(shí)驗(yàn)上面臨巨大挑戰(zhàn)。宿主DNA與微生物DNA的共提取導(dǎo)致后續(xù)測(cè)序數(shù)據(jù)中大部分是宿主的基因組數(shù)據(jù)，從而使微生物組的數(shù)據(jù)不足，還可能產(chǎn)生干擾下游分析的非特異性信號(hào)。解決這個(gè)問(wèn)題有兩種方法：要么需要去除宿主DNA，要么需要增加測(cè)序深度以獲取足夠的微生物基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)分析。然而增加測(cè)序深度可能更昂貴，因此我們比較了幾種去除宿主DNA的微生物基因組抽提方法。

材料與方法

1）材料

糖尿病足感染樣本；

2）方法（試劑盒）

1. High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche Life Science, Basel, Switzerland)
2. NEBNext Microbiome DNA enrichment kit(NEB Inc., Ipswitch, MA, USA)
3. Molzym Ultra-Deep Microbiome Prep (Molzym G-020-050, Bremen, Germany)
4. QIAamp DNA Microbiome Kit (Qiagen, Hilden, Germany)
5. HostZERO microbial DNA kit (Zymo Research, California, USA)

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果展示

1. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

糖尿病足感染樣本勻漿混樣，平均分成15份，每份25mg，用5種方法抽提DNA，并對(duì)所得DNA進(jìn)行定量PCR及16S rDNA 擴(kuò)增測(cè)序以檢測(cè)物種多樣性。

圖1

2. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果-DNA質(zhì)量評(píng)價(jià)

從表1可以看出，五種方法抽提的DNA用NanoDrop™2000c（Thermo Scientific）分光光度法測(cè)定提取的DNA產(chǎn)量和純度約為1.8（260/280），基本符合要求。TapeStation 2200顯示DNA完整性（DIN）在7到9之間，這表明DNA沒(méi)有碎片化（表1）。而Molzym、QIAamp和HostZERO的260/230比值較低。根據(jù)Qiagen應(yīng)用說(shuō)明，260/230比率低很可能是由于在基于柱的試劑盒中裂解緩沖液經(jīng)常使用的胍殘留所導(dǎo)致，但這不影響下游qPCR檢測(cè)。

表1 不同方法抽提DNA的各項(xiàng)指標(biāo)

3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果-DNA成分鑒定

使用細(xì)菌16S特異引物(5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’和5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’)和人18S特異引物（5’-GGTGGTGCCCTTCCGTCA-3’ 和 5’-CGATGCGGCGGCGTTATT-3’），通過(guò)定量PCR檢測(cè)DNA樣本中宿主和細(xì)菌DNA的占比，結(jié)果顯示，NEBNext法的宿主DNA污染程度高，HostZERO法和QIAamp法的宿主DNA污染程度低（NEBNext>Molzym>QIAamp>HostZERO）（圖2）對(duì)照樣品18S/16S rRNA比值為0.865±0.020。而NEBNext法和Molzym法提取的DNA樣本的18S/16S rRNA比值分別為0.701±0.022和0.393±0.057，仍然比較高。

相比之下，QIAamp法和HostZERO法的18S/16S rRNA比值較低，分別為0.027±0.005和0.015±0.007，分別比對(duì)照法低了32倍和57倍。

圖2

4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果-微生物DNA占比

通過(guò)對(duì)定量PCR的數(shù)據(jù)進(jìn)行拷貝數(shù)計(jì)算結(jié)果表明，對(duì)照樣品中細(xì)菌DNA含量為（6.7±0.1%）。在去除宿主DNA后，NEBNext法的細(xì)菌DNA占比仍然比較低（8.1±0.2%），Molzym法略高（13.6±1.0%）。在QiaAmp法（71.0±2.7%）和HostZero法（79.9±3.1%）中，細(xì)菌DNA含量增加了10倍以上（圖3）。上述結(jié)果表明，HostZERO法和Qiamp法能有效地去除宿主DNA污染，富集微生物DNA。

圖3

5. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果-16S rRNA擴(kuò)增測(cè)序結(jié)果

使用16S rRNA V3V4區(qū)引物341（5‘-CCTAYGGGRBGCASCAG-3’）和806（3‘-GGACTACNNGGGTATCTAAT-5’）對(duì)樣本進(jìn)行擴(kuò)增及微生物多樣性檢測(cè)，結(jié)果表明：糖尿病足感染組織樣本微生物群共包含5個(gè)門，這些門在該樣本中常見(jiàn)。其中，硬壁門和放線桿菌的成員控制著細(xì)菌種群（圖4）。NEBNext與對(duì)照樣品的細(xì)菌物種組成（所有五種報(bào)告的菌門的提取）相似，這可能是因?yàn)檫@兩組樣本的DNA提取方法（Roche）一致，NEBNext另外增加了去宿主DNA的步驟。聚類分析也支持這一點(diǎn)，而HostZERO、Molzym和QIAamp形成了一個(gè)單獨(dú)的聚類（圖4A和圖4B）。在屬一級(jí)，鏈球菌主導(dǎo)著糖尿病足感染組織的微生物群，其次是消化鏈球菌（圖4B），與已有報(bào)道結(jié)果一致。總的來(lái)說(shuō)，本研究中使用的所有微生物組DNA富集方法都成功地識(shí)別了糖尿病足感染樣本中常見(jiàn)的以及臨床上分離出的重要的屬，其豐度與先前研究中的報(bào)告相對(duì)相似。

圖4

結(jié)論

由以上研究結(jié)果可知，在測(cè)試的五種抽提方法獲得的DNA質(zhì)量相近，但是量的差異比較大。不同的去宿主DNA的方法效果不一，以HostZERO的去宿主效果好，QIAamp的效果其次。用這幾種方法抽提的DNA進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增對(duì)微生物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果一致性較高，但是如果用于宏基因組測(cè)序，HostZERO和QIAamp抽提方法可能能夠更好的去除宿主基因組的影響。

參考文獻(xiàn)

Host DNA depletion efficiency of microbiome DNA enrichment methods in infected tissue samples, Fatemah Sadeghpour Heravi, Martha Zakrzewski, Karen Vickery, et. Al., 2020, Journal of Microbiological Methods, https://doi.org/10.1016/j.mimet.2020.105856

附表

表2 幾種宿主DNA去除方法的優(yōu)劣勢(shì)比較

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